红豆杉的组织培养技术

　　红豆杉是常绿乔木，小枝秋天变成黄绿色或淡红褐色叶条形，雌雄异株，种子扁圆形。种子用来榨油，也可入药。属浅根植物，其主根不明显、侧根发达，高30米，干径达1米。叶螺旋状互生，基部扭转为二列，条形略微弯曲，长1～2.5cm，宽2～2.5mm，叶缘微反曲，叶的端缘渐尖，叶背有2条宽黄绿色或灰绿色的气孔带，中脉上密生有细小凸点，叶缘绿带极窄，雌雄异株，雄球花常单生于叶腋，雌球花胚珠单生于花轴上部侧生短轴的顶端，基部有圆盘状的假种皮。种子扁卵圆形，有2棱，种卵圆形，假种皮杯状，红色。因为红豆杉的树皮有抗癌物质——紫杉醇，所以有许多人进入林中来剥树皮，使得红豆杉的数量急剧下降。

　　价值：红豆杉的药用价值主要体现在它的提取物——次生代谢衍生物——紫杉醇。“紫杉醇*早是从短叶红豆杉的种皮中分离出来的抗肿瘤活性成分。是治疗转移性卵巢癌和乳腺癌的*药物之一，同时对肺癌、食道癌也有显著疗效、对肾炎及细小病毒炎症有明显抑制。”紫杉醇的抗癌机理是：紫杉醇能与微量蛋白结合，并促进其聚合，抑制癌细胞的有丝分裂，有效阻止癌细胞的增殖。目前为了减少对野生红豆杉资源的破坏，人们开始计划用红豆杉的枝径叶部分，提取前体化合物10——去乙酰巴卡亭Ⅲ、然后用半合成办法制备药用紫杉醇。紫杉醇是目前世界上公认的广谱、强活性、抗癌药物、其具有独特的抗癌机理。目前，紫杉醇已经成为世界销量*的抗肿瘤药物。同时国外又在做紫杉醇对阿尔茨海默氏病及其他癌症方面的临床试验。当前情况下，人类获得紫杉醇的方法有：1、天然提取2、人工合成3、半人工合成4、生物发酵，而后三种方法大都停留在实验室阶段，所以红豆杉的植物组织培养价值也就显得尤为重要。

　　二、红豆杉的组织培养技术

　　（一）、材料

　　较为适宜的组培外植体为新生的嫩枝，取材时间以每年的7、8月份为宜

　　（二）培养过程

　　1、愈伤组织诱导用培养基

　　培养基的基本成分采用B5或MS的微量元素、有机物和铁盐，外加KNO32500mg/L,NH4NO3825mg/LKH2PO4240mg/L,MgSO4?7H2O370mg/L,CaCl2?2H2O660mg/L。添加的激素种类及数量为NAA0.8-1.0mg/L、BA0.3-0.5mg/L，调PH值为5.8-6.0；琼脂粉和蔗糖用量分别为5.6-6.0g/L和30g/L。配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用。

　　2、材料消毒与接种

　　取新生的嫩枝（带有针叶）放入加有0.02%洗洁精的自来水中浸泡10分钟，浸泡过程中需经常搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上。将嫩枝转入一干净的三角瓶中。

　　以下所有操作必须在超净工作台上进行无菌操作。首先往三角瓶中加入75%的酒精，加入量应为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌30-60秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水年漂洗*；再将嫩枝转入事先已高压消毒的三角瓶中，加入15倍与嫩枝体积的0.1%的升汞溶液，浸泡杀菌5-8分钟，浸泡过程中要不断摇动，以使升汞与嫩枝充分接触。为了达到彻底杀菌的效果，有人建议在升汞溶液中加入0.02%的表面活性剂，这样可能更好一些，但要相对缩短杀菌时间。倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗4-6次，每次1-2分钟，以彻底除去升汞。将嫩枝从三角瓶中分批取出，用无菌滤纸吸去材料表面的水分，将嫩枝切成0.5-0.8CM的小段，并切取部分针叶，嫩枝切段和针叶同时用作外植体，接种在诱导愈伤组织的培养基上。接种时要让针叶的腹面接触培养基，嫩枝的植物学近地端接触培养基。注意用过的升汞溶液和冲洗液不要到处乱倒，以防重金属污染。将接种好的培养物放置于培养室中培养，温度（25±2）℃，光照强度1500-2000lx，光照时间10h/d。

　　3、愈伤组织诱导

　　红豆杉嫩枝和针叶在培养基上2-3周后即开始形成愈伤组织，约4-5周愈伤组织直径可达1-2CM。不同种的红豆杉和不同的外植体之间形成愈伤组织的比率、时间早晚和生长速度存在明显差异，南方红豆杉和东北红豆杉的嫩枝切段出愈较快，出愈率分别为89%和70%，针叶出愈较慢，出愈率也较低，分别为36%和15%；普通红豆杉出愈较慢但出愈率较高，嫩枝和针叶的出愈率分别为94%和30%。愈伤组织开始时为灰白色，随着愈伤组织的增大，先期形成的愈伤组织颜色由灰白色变为棕色，这可能预示着愈伤组织在逐渐发生褐变，因此要及时给予注意，尽量保持较低的培养温度和经常更换培养基。当愈伤组织生长到一定大小时即可转入液体进行悬浮培养。

　　4、细胞悬浮培养与继代

　　利用愈伤组织而不是用小苗或大树来生产提取紫杉醇，是一条正在探索的途径，如果成功则可以实现工厂化生产，从根本上解决红豆杉资源不足的矛盾。因此，通过嫩枝和针叶培养产生的愈伤组织不需要进行芽分化的诱导，而是将愈伤组织直接转入细胞悬浮培养。具体做法是将从嫩枝和针叶上产生的愈伤组织取下来直接转入液体培养基中进行振荡培养，所用培养基与上述诱导培养基相同。在初次将愈伤转到液体培养基即可适当加入少量纤维素酶和果胶酶，以加快愈伤组织分离成单个细胞或小细胞团。

　　在初次悬浮培养阶段可用50ml的小三角瓶，每瓶加10ml液体培养基，放入愈伤组织，在20-23℃的摇床上振荡培养，光照条件与普通培养相同。每周需要更换*培养基，更换时用5-10ml的平头移液管将三角瓶中的愈伤组织、单个细胞或细胞团过滤出来，直接转到新鲜的培养基中即可。在悬浮培养过程中应随时注意每一瓶中愈伤组织、细胞团生长的情况，挑选生长速度*快和特征*的作为继代的材料，毫不可惜的丢掉那些不好的（生长缓慢、颜色不正等）材料，这样经过几代的选择，就可以挑出符合理想的材料，作为悬浮系进行扩增培养。

　　（三）紫杉醇含量的检测

　　现行的比较普遍有效的方法是利用薄层层析法，其大体过程是先将愈伤组织干燥，再用甲醇渗滤提取，获得提取液，经减压浓缩至干，用水：CHCl3取。合并CHCl3部分，再经减压浓缩获得粗提液，经薄层层析，收取喊紫杉醇和10-脱乙酰基巴卡丁-III的部分，再进行硅胶柱层析，分离收集相应流分，减压浓缩，TLC再次检测，将含有紫杉醇的浓缩液进行二次柱层析，鉴定结果。另外，红豆杉愈伤组织经过一定分离提取后，可进行高效液相色谱层析（HPLC）分析，分析柱为4mm*250mm的C18柱，dp=10μm，分离体系为甲醇-乙腈-水（20：33：47）等速洗脱，流速为1ml/min。

　　（四）结论

　　用植物组织培养这种先进的培养方法，能够迅速、大量的生产出目前人类急需的红豆杉，能够为癌症的治疗提供很大的方便，社会以及积极效益都非常的明显。

　　关于红豆杉植物组织细胞培养中褐化的问题是当前存在的一个重要问题，该现象与普通木本植物组培中出现的褐变不同。普通木本植物出现的褐变可通过选用较小的外植体、培养基中加活性炭、缩短继代转移周期、尽量少损伤外植体等措施加以克服，且以后不再发生。但是，利用上述方法解决红豆杉的褐化问题收效甚微，这或许是因为紫杉醇本身对细胞生长具有毒害作用，其量的积累往往对细胞的增殖起抑制作用。如何解决提高细胞内紫杉醇的含量而又不给细胞的生长带来很大影响，使二者相协调一致，是目前解决的必要问题。